Présentation générale
L'actualité scientifique
> Contrôle génétique de la charge virale et des réservoirs
> La transmission du VIH par les muqueuses
> VIH et tractus génital
> Sites et mécanismes d’intégration
> Détournement de l’immunité intracellulaire par le VIH
> Les cellules dendritiques plasmacytoïdes
> Immunité innée et cellules NK
> Contrôle génétique de la charge virale et des réservoirs
La plate-forme de génomique haut débit (GWAS), installée dans les locaux du site Pitié-Salpêtrière, est opérationnelle depuis le mois de mai 2007. Fruit d’un partenariat entre l’Anrs, l’Inserm et les universités Paris VI et XI, la plate-forme permet de cribler rapidement l’ensemble du génome humain et de localiser les régions de l’ADN qui contiennent des gènes polymorphes pouvant être à l’origine d’un phénotype donné. Cette approche vise à identifier de nouveaux gènes dont le polymorphisme peut influer sur l’évolution des maladies virales telles que les infections à VIH, VHC et VHB.
Une première étude a été publiée en 2008. Elle a été effectuée par un consortium d’équipes soutenues par l’Anrs chez des patients infectés par le VIH de phénotype clinique ou biologique bien documenté. Les chercheurs ont analysé le profil génétique de 605 personnes récemment infectées par le VIH au sein de la cohorte Anrs Primo CO 06 et ont suivi l’évolution de leur maladie grâce à deux indicateurs : l’ARN viral plasmatique, reflet de la réplication virale, et l’ADN viral présent dans les lymphocytes, reflet du niveau de cellules hébergeant le génome viral, également dénommé « réservoir viral ». Les corrélations existant entre les variations génétiques trouvées chez les patients et les quantités d’ARN viral et d’ADN viral correspondantes ont été analysées. Trois régions du génome humain ont été identifiées comme ayant une influence sur l’un des deux paramètres étudiés. Une première située dans la région du complexe majeur d’histocompatibilité sur le chromosome 6 (6p21), à proximité des gènes de classe I et III, est associée à un faible taux d’ARN viral lors de la primo-infection, traduisant un bon contrôle de la réplication virale par l’organisme. La forme protectrice de cette région est surreprésentée dans une cohorte de 45 patients caucasiens « contrôleurs du VIH » qui, infectés depuis plus de 10 ans, contrôlent leur charge virale et ne développent aucun signe de la maladie. Les deux autres régions, situées sur les chromosomes 8 et 17, sont, elles, associées à un taux d’ADN viral intracellulaire bas, c’est-à-dire à une constitution lente du réservoir. C’est la première fois qu’une étude de ce type identifie de nouvelles régions génomiques influençant l’intégration du virus dans les cellules humaines. Ces trois régions du génome contiennent donc des gènes polymorphes en cours d’identification qui diffèrent d’un individu à l’autre et dont les mutations peuvent entraîner des changements, soit dans l’expression, soit dans la structure des protéines qui sont à l’origine du contrôle de la réplication et de l’intégration virales. L’objectif est maintenant d’identifier les gènes en cause et leurs fonctions en revenant à des mécanismes de recherche plus classiques. Le même type d’étude est en cours dans des cohortes de patients infectés par le VHC.
> La transmission du VIH par les muqueuses
Le VIH est essentiellement transmis par voie sexuelle et il est nécessaire de mieux connaître les premières étapes de l’entrée du virus dans les muqueuses génitales afin d’élaborer de nouvelles stratégies d’inhibition. La modélisation in vitro de différents types de muqueuses représente donc un outil très précieux pour étudier ces mécanismes et tester des inhibiteurs. Une équipe financée par l’Anrs a développé un modèle de muqueuse vaginale pluristratifiée reconstruite contenant des fibroblastes, des kératinocytes et des cellules de Langerhans qui présente les caractéristiques histologiques d’une muqueuse vaginale. Elle a également mis au point deux modèles de prépuce, explant et reconstruction in vitro, à partir des faces interne ou externe du prépuce humain. Ces modèles ont permis de montrer que :
- la transmission du VIH se fait essentiellement à partir de cellules infectées par le VIH et non à partir de virus libre ;
- le devenir des particules virales dans chacune des faces du prépuce est très différent. En effet, les particules virales restent piégées dans la couche épaisse de kératine du prépuce externe où les cellules de Langerhans viennent les capturer, probablement pour les dégrader. Au contraire, les nombreuses cellules de Langerhans de l’épiderme du prépuce interne captent très rapidement le virus, ce qui entraîne leur migration vers la jonction avec le derme où résident les lymphocytes CD4. C’est là que se produira le transfert du virus des cellules de Langerhans aux lymphocytes CD4 et que la dissémination du VIH sera initiée.
Ces modèles pourraient fournir des bases biologiques à la protection de l’infection observée après circoncision.
Sur le plan moléculaire, la même équipe a obtenu des données structurales sur un peptide conservé de gp41 qui lie le récepteur au VIH des cellules épithéliales. La conformation de ce peptide a été étudiée dans un environnement lipidique mimant les membranes cellulaire ou virale. Ces informations ont été utilisées dans l’élaboration d’un immunogène capable d’induire des anticorps neutralisant le VIH, notamment au niveau des muqueuses.
Le sperme est un vecteur essentiel de la dissémination du VIH, mais l’origine des virions et des cellules infectées qu’il contient reste largement méconnue. Une étude originale a permis de suivre l’infection par le SIV des différents organes de l’appareil génital mâle chez le primate. L’infection débute très tôt au cours de la primo-infection, persiste en phase chronique et corrèle avec la charge virale plasmatique. Elle concerne majoritairement la prostate et les vésicules séminales. L’ARN et les antigènes viraux sont détectés dans les lymphocytes T et quelques cellules germinales. Une activation immune locale est également observée, excepté dans le testicule. L’analyse des espèces virales indique que les populations virales du sang et du tractus génital ont des similitudes mais présentent aussi des différences. Ceci conforte la notion de compartimentalisation du tractus génital qui serait d’abord envahi par les souches virales sanguines puis serait le siège d’une production et d’une évolution locale de nouveaux variants.
La même équipe a mis en évidence une production locale de VIH in vitro dans des explants de prostate humaine par immunocytochimie. De façon intéressante, les lymphocytes T et les macrophages répliquent beaucoup mieux les souches R5 que les souches X4 et les souches à double tropisme, suggérant une possible participation de cet organe à la transmission sexuelle préférentielle des souches R5 .
> Sites et mécanismes d’intégration
L’intégration est une étape essentielle du cycle viral. Pour se répliquer, le virus doit intégrer une copie d’ADN complémentaire de son génome ARN dans les chromosomes cellulaires. Des équipes soutenues par l’Anrs ont progressé dans la compréhension des mécanismes d’intégration. La molécule LEDGF/p75 est un cofacteur essentiel de l’intégrase et joue notamment un rôle dans le ciblage de l’ADN viral sur le chromosome. Elle est capable de se lier à la fois à l’intégrase et à la chromatine. Des résidus critiques de son domaine de liaison (PWWP) à la chromatine ont été caractérisés. La structure de la chromatine est un facteur important qui contrôle l’intégration et il est important de disposer de tests in vitro mimant au mieux la situation physiologique. Jusqu’à présent, les tests fonctionnels d’activité d’intégrase étaient réalisés sur de l’ADN nu. La même équipe a montré qu’in vitro LEDGF/p75 est très efficace pour stimuler l’activité de l’intégrase dans un test proche de la situation physiologique utilisant un ADN « chromatinisé » par l’adjonction de nucléosomes. La connaissance précise des mécanismes et des sites d’intégration de l’ADN viral ouvre des perspectives pour concevoir de nouveaux inhibiteurs. L’expertise et les compétences des équipes françaises travaillant sur l’intégrase leur ont en outre permis de collaborer avec des cliniciens pour caractériser les mutations associées à la résistance au raltégravir.
> Détournement de l’immunité intracellulaire par le VIH
La capacité de réplication cellulaire des lentivirus VIH-1, VIH-2 et SIV est différente selon les espèces et au sein d’une même espèce, selon le type cellulaire qu’ils infectent. Certaines cellules sont non permissives à la réplication d'un virus par manque d'un récepteur d'entrée, mais d'autres restreignent la réplication en s'opposant à certaines étapes du cycle viral par des mécanismes de défense intracellulaires. C’est le concept d’immunité intracellulaire ou immunité intrinsèque. Les rôles des « protéines auxiliaires », Vif, Vpu, Vpr, Vpx et Nef des lentivirus dans le cycle de réplication virale et dans la physiopathologie du sida ont été largement étudiés. L’observation que des virus dépourvus de certaines de ces protéines ne se répliquent pas dans certains types cellulaires suggère que ces protéines virales permettent de contrecarrer les mécanismes de l’immunité intrinsèque d'une cellule. Ainsi, les protéines Vpr et Vpx, par exemple, permettent la réplication du VIH-1 et des SIV, respectivement, dans des cellules qui seraient non permissives (les macrophages et les cellules dendritiques myéloïdes), alors qu’elles ne sont pas indispensables pour la réplication des virus dans des cellules qui se divisent activement. L'Anrs finance des équipes qui travaillent activement sur l'interaction de Vpu, Vpr et Vpx avec les ubiquitines ligases, protéines responsables de l’adressage des protéines cellulaires vers la machinerie de dégradation, le protéasome. Une équipe soutenue par l’Anrs a decrypté le mécanisme d’action de Vpr dans l’arrêt du cycle cellulaire en fin de phase G2 dans les cellules infectées par le VIH. En se liant à la protéine cellulaire DCAF-1, Vpr dirige les ubiquitines ligases vers des protéines cellulaires vraisemblablement nécessaires à la progression du cycle cellulaire. Ces données ont été confirmées de façon indépendante par plusieurs équipes étrangères et françaises, et étendues à Vpx.
Parallèlement, une autre équipe soutenue par l’Anrs a étudié le rôle de Vpr et Vpx dans les phases précoces de l’infection des macrophages et des cellules dendritiques. Cette équipe a montré que Vpx abroge des restrictions et permet la réplication non seulement des lentivirus de la lignée VIH-2/SIVmac, où on trouve Vpx naturellement, mais aussi de nombreux autres rétrovirus dans les cellules myéloïdes humaines. L'incorporation du gène vpx dans des vecteurs rétroviraux a augmenté leur efficacité de transduction dans les cellules dendritiques myéloïdes, ce qui présente un intérêt pour la conception de vecteurs vaccinaux.
> Les cellules dendritiques plasmacytoïdes
La sous-population des cellules dendritiques (DC) plasmacytoïdes présente l’antigène aux lymphocytes, mais elle est également une source importante d’interféron alpha lorsqu’elle rencontre des pathogènes comme le VIH. L’interféron alpha possède une activité antivirale mais module également la réponse du système immunitaire. Le rôle des DC plasmacytoïdes dans la pathogénèse du sida est encore mal connu. Une équipe financée par l'Anrs a analysé la dynamique de ces cellules au cours de l’infection par le SIV en relation avec d'autres paramètres de la réponse immunitaire, dans un modèle du sida chez le primate. Les DC plasmacytoïdes sanguines sont très rapidement relocalisées vers les ganglions lymphatiques, dès le début de l'infection. La réponse interféron alpha est corrélée positivement à la charge virale, à l'induction de cellules T régulatrices, et à l'activité d'une enzyme associée à l'immunosuppression et impliquée dans le métabolisme du tryptophane, l'indoléamine 2,3-dioxygénase. Ces travaux suggèrent que les DC participent à la suppression de la réponse immunitaire au VIH. La compréhension de ces mécanismes de régulation pendant la primo-infection devrait permettre de mieux prévoir l'évolution à long terme vers la maladie et de concevoir des stratégies d’immunomodulation.
> Immunité innée et cellules NK
L’immunité innée joue un rôle critique au tout début de l’infection, avant que ne se mette en place la réponse immunitaire spécifique. Les cellules NK (natural killer) secrètent des cytokines et exercent une fonction cytotoxique grâce à une batterie de récepteurs qui leur permet de reconnaître les cellules anormales ou infectées. Les cellules NK peuvent ainsi interagir et communiquer avec plusieurs types de cellules, parmi lesquels les cellules dendritiques et les lymphocytes T. Deux études mettent en évidence de nouveaux mécanismes d’action de ce type cellulaire au cours de l’infection par le VIH.
Une équipe a ainsi montré dans un système de culture in vitro qu’une sous-population de cellules NK exprimant le récepteur CD85j contrôle négativement la réplication du VIH dans des cellules dendritiques infectées. Cette activité n’entraîne pas la mort des cellules dendritiques et serait probablement transmise par un ligand inconnu de CD85j, préférentiellement exprimé par les cellules dendritiques infectées.
Une seconde équipe a mis en évidence une augmentation de l’expression à la surface des lymphocytes CD4 d’une molécule, NKp44 ligand, qui se lie à un des récepteurs des cellules NK chez les patients infectés. Les lymphocytes CD4 deviennent alors très sensibles à la lyse par les cellules NK et ce mécanisme pourrait être à l’origine d’une perte importante de lymphocytes CD4. La molécule NKp44 ligand est induite in vitro par le contact avec un court fragment de la protéine d’enveloppe du VIH, le peptide 3S. Chez les patients, la présence d’anticorps anti3S est associée au maintien du nombre de CD4, suggérant que le « masquage » du peptide 3S par des anticorps empêche l’expression de NKp44 ligand et la mort des CD4. Ces observations ont conduit l’équipe à postuler qu’une immunisation active avec le peptide 3S pourrait inhiber l’effet pathogène des cellules NK et un essai a été entrepris chez le primate. Il a conduit à la production d’anticorps anti-peptide, à la prévention de l’augmentation de la molécule NKp44 ligand et de la chute du nombre des lymphocytes CD4 chez l’animal infecté. Ces travaux constituent une approche originale d’immuno-intervention visant à contrôler la pathogénèse et le développement de la maladie.
